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小鼠肝炎病毒(MouseHepatitisVirus，MHV)是一种RNA病毒，病毒存在于血液和内脏，特别是肝和肾，也见于粪尿中，对幼鼠有高度的传染性，小鼠肝炎是由MHV所致的1种特有的传染病，带毒小鼠分布于全世界，但在正常情况下大多呈不显性感染，只在应激因素激发下才能成为致死性疾病，主要为肝炎和脑炎，因此小鼠肝炎病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。

1. 即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
   
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
   
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
   
4. 特异性高，引物是根据小鼠肝炎病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒的RNA发生交叉反应。
   
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5各数量级。
   
6. 本制品足够50次20μL体系的探针法qRT-PCR反应。
   
7. 本制品只能用于科研。

1. 标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。
   
2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液(最好用带芯枪头，下同)。
   
3. 在6号管中加入5μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
5. 换枪头，在4号管中加入5μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上用。

7. 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次样本制备所要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
   
8. 用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上多数RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号管中的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为描述操作步骤。
   
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):
    

    成分	样品管 N+2个	PCR阴性 对照管	PCR阳性 对照管(2～6管)
    探针法qRT-PCR缓冲液	10μL	10μL	各10μL
    探针法qRT-PCR酶混合液v2	各1μL	1μL	各1μL
    小鼠肝炎病毒探针法qRT-PCR引物-探针混合液	3μL	3μL	各3μL
    待测样品RNA模板	各6μL	不加	不加
    超纯水	不加	6μL	不加
    第7步所得标准曲线样品稀释液(2～6号)	不加	不加	各6μL

    
    
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行qRT-PCR：
    

    过程	温度	时间
    逆转录	50℃	10min
    预变性	94℃	10min
    qRT-PCR反应 (45个循环)	94℃	15sec
    	60℃	1min(采集FAM通道的荧光信号，淬灭基团为MGB-NFQ)

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
    
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须没有读数，或者大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40。对待测样品，如果其Ct没有读数、大于或等于40则均为阴性，如果小于40则为阳性。